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Stressreaktion bei C. elegans: C. elegans ist ein etablierter Modellorganismus zur Untersuchung von Stressreaktionsmechanismen. Der Wurm ist in der Lage, auf eine Vielzahl von Stressfaktoren zu reagieren, darunter Temperatur (Hitze, Kälte), oxidativer Stress, Strahlung und Infektionen, indem er ein komplexes Netzwerk aus Signalwegen und Transkriptionsregulatoren aktiviert.
Einer der wichtigsten Signalwege, die an der Stressreaktion bei C. elegans beteiligt sind, ist der Insulin/IGF-1-Signalweg, der bei vielen Arten konserviert ist. Als Reaktion auf Stress wird dieser Signalweg gehemmt, was zur Aktivierung nachgeschalteter Effektoren wie dem FOXO-Transkriptionsfaktor DAF-16 führt. DAF-16 aktiviert dann die Expression von Stressreaktionsgenen, einschließlich derjenigen, die an der Produktion von Hitzeschockproteinen, der Reaktion auf oxidativen Stress und der Reparatur von DNA-Schäden beteiligt sind.
Ein weiterer wichtiger Signalweg bei der Stressreaktion bei C. elegans ist der mTOR-Signalweg (mechanistisches Ziel von Rapamycin). Die beiden mTOR-Komplexe mTORC1 und mTORC2 haben unterschiedliche Funktionen und Regulationen. Während mTORC1 Wachstum und Proliferation fördert und die Stressreaktion unterdrückt, wurde gezeigt, dass mTORC2 die Stressreaktion verstärkt und die zelluläre Widerstandsfähigkeit gegenüber Stress fördert.
Zu den weiteren Signalwegen, die an der Stressreaktion bei C. elegans beteiligt sind, gehören die Unfolded Protein Response (UPR), die als Reaktion auf die Ansammlung fehlgefalteter Proteine im endoplasmatischen Retikulum aktiviert wird, und der p38 MAPK-Signalweg, der als Reaktion auf verschiedene Stressfaktoren aktiviert wird. einschließlich Hitzeschock und oxidativem Stress.
Proteinmodifikationen und –Interaktionen der FOXO/DAF-16 und mTORC vermittelten Stressantwort
Wir untersuchen das intensive Wechselspiel des Insulin/IGF und des mTORC Signalweg, das notwendig ist, um organismische Reaktionen auf Außeneinflüsse (Ernährung, Stress) zu regulieren. Dazu haben wir zunächst die Wechselwirkungen und das Phosphorylierungsmuster eines Schlüsseleffektors beider Signalwege, des Transkriptionsfaktors FOXO/DAF-16, identifiziert. Wir konnten zudem zeigen, dass Astrin, ein wesentlicher Interaktor von mTORC1, die Assoziierung des mTORC1 Komplexes inhibiert und Raptor, eine Komponente dieses Komplexes, zu den Stressgranuli der Zelle rekrutiert (Thedieck et al., Cell, 2013). Es gelang uns, 14 S/T Phosphorylierungsstellen im DAF-16 Protein mittels Massenspektrometrie zu identifizieren und wir untersuchen derzeit ihren Beitrag zur Funktion und intrazellulären Lokalisierung von DAF-16. Zudem fanden wir, dass die Transkription des sgk-1 Gens, das für die Serum-und-Glucocorticoid-induzierbare Kinase SGK-1 kodiert, für die DAF-16 Interaktor und Substrat ist, darüberhinaus auch von DAF-16 reguliert wird. Weiterhin wird SGK-1 Aktivität über Phosphorylierung durch mTORC2/Rictor kontrolliert, so dass auf mehreren Ebenen ein SGK-1 vermittelte Stressantwort reguliert werden kann. Unsere Arbeitshypothese geht davon aus, dass SGK-1 Teil einer Rückkopplungsregulation ist, die dazu dient, DAF-16 und andere Komponenten der Insulin und mTORC Wechselwirkungen in der Zelle zu lokalisieren und in ihrer Aktivität zu beeinflussen. Wir untersuchen daher derzeit die funktionelle Spezifität der Wechselwirkungen und Regulationsmechanismen von SGK-1 mittels genetischer und biochemisch/proteomischer Studien in Zellkultur und C. elegans.
Identifizierung eines regulatorischen GTPase/Kinase Netzwerks zur Kontrolle zytoskeletaler Dynamik während der Zellmigration und Tumorgenese
Dieses Projekt versucht zu verstehen, wie kleine GTPasen, die Zelladäsion und Migration steuern, durch die GTPase/Kinase LRRK2, die PTEN-induzierbare Kinase PINK-1, und die Serum-und-Glucocorticoid-induzierbare Kinase SGK-1 reguliert werden. Wir konnten kürzlich zeigen, dass LRRK2 und sein C. elegans Homolog LRK-1 antagonistische Funktion zu PINK-1 besitzen, und dadurch gemeinsam Zellmigration in der C. elegans Stammzellnische, intrazelluläre Dynamik bei der Tumorgenese, Zellinvasion und beim Zelltod regulieren. Um die zugrundeliegenden Mechanismen zu identifizieren, haben wir Zellkultur- und C. elegans Tiermodelle etabliert, die z.B. eine hyperaktive Variante des humanen LRRK2 (G2019S) oder seines C. elegans Homologs LRK-1 (G1876S) exprimieren. Diese Varianten führen zu schweren Zellmigrations- und Tumorphänotypen. Nun wollen wir die genetischen Modulatoren des von G2019S ausgelösten Defekts und des beteiligten funktionellen Netzwerks identifizieren. Ein starker Modulator wird vom sgk-1 Gen kodiert. Unsere Arbeitshypothese geht davon aus, dass die SGK-1 Kinase an Komponenten der Endomembranen bindet, und so über die Proteinwechselwirkungen und Phosphorylierungen deren Aktivität kontrolliert. Kandidaten dafür sind die Rho-ähnlichen kleinen GTPasen, die auch im Wechselspiel mit LRRK2 und PINK-1 stehen. Wir möchten nun den Mechanismus verstehen, mit dem SGK-1 den Defekt von Parkinson-typischen LRRK2 G2019S Mutanten beeinflussen kann. In einem weiteren Modell, das an anderem Ort beschrieben wird, identifizierten wir SGK-1 auch als Modulator der Dysregulation von Akt und FOXO/DAF-16, was zu einer nicht-zellautonomen Induzierung von Stammzelltumoren und Metastasierungs-ähnlichen Phänomenen im C. elegans Modell führt.
SGK sensors for in vitro/in vivo dissection of signaling controlling membrane dynamics (Kollaboration mit AG Meier/Zengerle, IMTEK)
Veränderungen im Membantransport zwischen endoplasmatischem Reticulum, Golgi, Lysosom, aber auch Mitochondrien und der Plasmamembran kristallisieren sich immer mehr als ursächlich für die Entstehung neurodegenerativer Erkrankungen, allen voran Alzheimer und Parkinson, sowie bei Tumorerkrankungen heraus. In der vorherigen Förderperiode hat unsere Abteilung an der Entwicklung von Sensoren und Ausleseverfahren, sowohl in C. elegans als auch Tumorzellkulturen, mitgearbeitet, um Anomalien im Membrantransport der Zelle und seine Konsequenzen für intra- und interzelluläre Signalwege zu verstehen. Wir haben dabei mit der AGC Kinase SGK-1 (serum-and-glucocorticoid inducible kinase 1) einen Schlüsselregulator im Membrantransport und bei der Regulation von Proteinkomplexen an der Membran identifiziert. Auch die Lokalisierung von SGK-1 ist hochdynamisch und integriert sowohl Aktivierung aus den Insulin/IGF und mTORC Signalwegen. SGK-1 moduliert die Dynamik der intrazellulären Präsenz des Transkriptionsfaktors FOXO, der sowohl tumor-suppressive als auch onkogene Eigenschaften haben kann. Über eine negative Rückkopplung reguliert FOXO wiederum die Expression von SGK-1. Diese Rückkopplungsschleife reagiert auf Nahrungsbestandteile, Steroide und Hormone, aber auch auf osmoregulatorische Veränderungen und Stress, und steuert so nicht nur den Fettmetabolismus, sondern auch, neben Stresstoleranz und Alterung, Tumorempfänglichkeit und Neurodegeneration. Dafür haben wir Veränderung im intrazellulären Membrantransport verantwortlich machen können, die wir nun im Detail verstehen wollen. Zu diesem Zweck nutzen wir neueste Verfahren, darunter CRISPR/Cas9 Genomediting, um synthetische optische SGK-1 Sensoren zu entwickeln, mit denen wir Transport- und Proteinkomplexdynamik studieren wollen.
Nicht-zellautonome Induktion von Keimbahn Stammzelltumoren durch ein Wechselspiel von Insulin/IGF und TGFß/BMP Signalwegen.
Anschubfinanzierung durch eigene Haushaltsmittel, dieses Projekt soll Grundlage zukünftiger Verbundforschung (insbesondere SFB Initiative von Prof. Meisinger (Protein Machines) werden.
Die postreproduktive Aktivierung des FOXO Transkriptionsfaktors DAF-16 bei reduziertem Insulin/IGF Signalweg wird allgemein als in den verschiedensten Organismen vorteilhaft angesehen wegen seiner Fähigkeit, Lebenserwartung bei gleichzeitiger erhöhter Stresstoleranz und Gesundheit zu verlängern. In der Keimbahn inhibieren zell-autonome Funktionen von FOXO/DAF-16 die Zellvermehrung und wirken dadurch tumor-suppressiv. Im Gegensatz dazu konnten wir vor einiger Zeit zeigen, dass epidermale Expression von DAF-16 einen tumorähnlichen Phänotyp auslösen kann, der sich durch Hyperproliferation von Stammzellen sowie der Invasion einzelnder Zellen in die Basalmembran auszeichnet. Wir haben die Gründe für diesen Tumorphänotyp identifiziert und finden, dass ein Wechselspiel zwischen DAF-16 und Effektoren des TGFß/BMP Signalwegs dafür verantwortlich sind. Inhibierung einzelner Bestandteile im BMP Signalweg, z.B der Gene für SMA-6/BMP Rezeptor, den R-Smad Proteinen SMA-2 und SMA-3, sowie SMA-9/Cofaktor Schnurri blockierten Keimbahnhyperproliferierung nahezu vollständig. Wir wissen inzwischen, dass DAF-16 im Zellkern direkt mit SMA-2 und SMA-3 interagiert, und auf diese Weise Gene des mTORC1 Signalwegs und von MADM/NBRF/HPO-11, dem Homolog eines wenig verstandenen humanen Tumorsuppressors, reguliert. Die Inhibierung aller identifizierten Zielgene in der Epidermis, nicht aber in der Keimbahn, blockierte Tumorbildung. Dies lässt auf eine nicht-zellautonome Tumorinduktion aus der Epidermis schließen, die zu Tumorwachstum im anderen Gewebe, der Keimbahn/Gonade, führt. Solche zellverbandsübergreifenden Tumorentstehungen sind auch beim Menschen beschrieben, aber durch die notwendige Komplexität der Zellmodelle sehr schwierig zu studieren. Unser C. elegans Modell bietet sich dazu als hervorragende, preiswerte, und ethisch unkomplizierte Variante an. Wir haben inzwischen Hinweise auf den Mechanismus der Übertragung der Tumoreigenschaften von einem zum anderen Gewebe, an dem kleine, regulatorische RNAs sowie die Bildung von sekretierten Vesikeln beteiligt zu sein scheinen. Für beide Phänomene gibt es Hinweise auch bei menschlichen Tumoren, so dass wir hier eine hervorragende Möglichkeit haben, Tumorentstehung mechanistisch zu untersuchen und zu verstehen.
